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| 虎奶菇液體菌種制作及質量檢驗方法 |
| 發布者： 發布時間：2015/8/16 閱讀：2284次 |
（江國志）
摘要：液體菌種是指菌絲體的純培養完全在液體培養基中進行培養而成的菌種。應用液體菌種進行虎奶菇生產能顯著提高產量和質量，便于工廠化和標準化生產。本文綜述了虎奶菇液體菌種的優勢，制作及質量檢驗方法。
隨著國內外市場對虎奶菇產品需求的增加，虎奶菇生產方式由小戶型、季節性生產的模式逐漸向工廠化、標準化、周年化、規模化生產發展。伴隨新技術、新工藝、新設備的研發問世，采用深層培養工藝制備虎奶菇液體菌種已應用于生產中。由于液體菌種具有成本低、生產周期短、菌齡一致、接種簡便快捷、便于管理等優點，因而深受虎奶菇栽培者的歡迎。
一、虎奶菇液體菌種的生產方式
一般可分為電磁攪拌法、搖瓶機法、簡易深層發酵（吹氧）法、發酵罐法。
1、電磁攪拌法。設備技術比較簡單，投資較少，但生產量小，生產的液體菌種是菌絲團。
2、搖瓶機法。搖瓶機培養投資少，設備技術簡單，管理方便，適合一般菌種廠生產使用，生產出來的液體菌種是菌球。
3、簡易深層發酵（吹氧）法 。 制作工序繁瑣、配套設備要求較高、各部件必須在無菌條件下進行組裝，生產的液體菌種是菌球。
4、發酵罐法 。 需要一整套的發酵設備，投資大，技術要求嚴格，只適用于工廠化的大規模生產，生產出來的液體菌種是菌球。
二、虎奶菇液體菌種的培養方法
通常采用搖瓶機法和簡易深層發酵（吹氧）法來生產培養液體菌種。若小規模生產，一般可采用搖瓶機法培養液體菌種。本文主要介紹搖瓶機振蕩培養技術。
1、 虎奶菇液體培養基配方
（1）土豆20%（煮汁）、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂 0.05%、維生素B1 2片、水1000ml、pH值自然。
（2）土豆30%（煮汁）、蔗糖１%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、維生素B1 2片、水1000ml、pH值自然。
（3）土豆20%、葡萄糖2%、玉米粉2%、黃豆粉1%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、水1000ml、pH值自然。
（4）葡萄糖1%、蛋白胨1%、酵母膏0.l%、磷酸二氫鉀 0.1%、硫酸鎂 0.05%、生長素5ml、水1000ml、pH值自然。
（5）葡萄糖2%、蛋白胨0.2 %、磷酸二氫鉀0.046 %、硫酸鎂0.05 %、磷酸氫二鉀0.1 %、水1000ml、pH值自然。
（6）葡萄糖2%、蛋白胨0.4%、牛肉膏0.4%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05 %、維生素B1 2片、水1000ml、pH值自然。
（7）葡萄糖3%、豆 粉2%、玉米粉1%、硫酸鎂？0.05%、磷酸二氫鉀0.1%、酵母粉0.5%、水1000ml、pH值自然。
（8）葡萄糖2%、蛋白胨1%、玉米粉2%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、水1000ml、pH值自然。
（9）葡萄糖2%、黃豆粉1%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.04%、氯化鈉（食鹽）0.03%、味精0.01%、維生素微量、水1000ml、 pH值自然。
（10）蔗糖3%、天門冬酰胺0.1 %、磷酸二氫鉀0.125 %、硫酸鎂0.03 %、氯化鈉（食鹽）0.05 %、水1000ml、pH值自然。
2、液體培養基的制作
（1）按配比精確稱取各種營養物質。
（2）配制溶液。為避免發生沉淀，可將各種營養成分單獨溶解分別制成母液，加入的順序一般是先加緩沖化合物，溶解后加入主要元素，然后是微量元素，再加入維生素等。最好是每種成分完全溶解后，再加入第二種營養成分。若各種成分均不發生沉淀，也可以一起加入。
若用馬鈴薯、玉米粉、黃豆粉等原料時，應先制取這些原料煮汁，然后再把煮汁與其它成分混合。
例如：配方一液體培養基的配制。 土豆20%（煮汁）、葡萄糖2%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂 0.05%、維生素B1 2片、水1000ml、pH值自然。
（3）將新鮮土豆洗凈去皮、挖掉芽眼的土豆切成小塊放入小鍋或大燒杯中，加入一定量的水，用文火煮沸30分鐘左右，至土豆軟而不爛時，用6～8層布過濾，取濾汁于鍋中。
（4）補水。 加水至1000～1200 ml。
（5）按配方順序加入需加的其他營養物質，文火煮5～10分鐘。
（6）充分攪拌均勻，并調PH。
一般用10％HCl或10％NaOH調pH，用pH試紙（或pH檢測儀）進行測試。
（7）沉淀分裝。 培養液配制好后，沉淀1小時取上清液，分裝入500mL容量的三角燒瓶中，每瓶裝量為100mL;750mL的瓶裝量為200mL;1000mL的瓶裝量為300mL，在配制培養液時，可加入0.02%的植物油或0.06%的泡敵（聚環氧丙烷甘油醚）作為消泡劑消泡，防止在培養過程中培養液產生氣泡。為了擊碎菌絲每瓶內加入5～10粒小玻璃珠。
（8）塞棉塞 。棉塞松緊適度，不宜過緊。加棉塞后再包扎牛皮紙封口，這樣既可過濾空氣，避免雜菌侵入，又可減緩培養基水分的蒸發。
（9）用記號筆注明培養液的名稱和日期。
（10）滅菌
① 首先將內層滅菌筒取出，再向外層鍋加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。
② 放回滅菌桶，將包扎好的三角瓶直立放入滅菌桶內，蓋上牛皮紙，三角瓶不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。
③加蓋，將蓋上的排氣軟管插入內層滅菌桶的排氣槽內。再以兩兩對稱的方式同時旋緊相對的兩個螺栓。
④ 通電加熱，并同時打開排氣閥，使水沸騰排除鍋內的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關上排氣閥，讓鍋內的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，在1.0～1.1kg/cm2壓力下，滅菌30分鐘。當鍋內壓力升到所需壓力時，控制熱源，維持壓力至所需時間。
⑤ 滅菌所需時間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內溫度自然下降，當壓力表的壓力降至0時，緩慢打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時，打開排氣閥，就會因鍋內壓力突然下降，使容器內的培養液由于內外壓力不平衡而沖出三角瓶，造成棉塞沾染培養液而發生污染。
三、搖瓶機振蕩培養技術
滅菌結束后，取出培養液冷卻到30℃以下時，在無菌條件下接入一塊約2厘米的斜面菌種，菌絲面向上懸浮于培養液液面。在20℃～22℃條件下避光靜置培養48小時，再置往復式搖瓶機上振蕩培養，振蕩頻率為80～120次/分，振幅6厘米～10厘米。如果用旋轉式搖瓶機，振蕩頻率為200～220轉／分。搖瓶機室溫控制在22℃～25℃，冬季室內溫度低，可將搖瓶機放入恒溫箱內培養。培養時間一般是在5～7天左右。
四、虎奶菇液體菌種的檢驗方法
虎奶菇液體菌種進行質量檢驗可采用感官檢查、顯微鏡檢查、空白培養基檢查和取樣測驗等方法。
采用電磁攪拌法培養或搖瓶機法培養液體菌種，終止培養后，常用目測法檢驗，將三角瓶搖晃靜止后，如菌絲球均勻地分布于三角瓶中，培養液清澈、無異味，液體中懸浮著大量均勻的小菌絲球，并伴有虎奶菇特有的香味，表示符合質量要求。
簡易深層發酵（吹氧）法或發酵罐法大量生產液體菌種，為了更好地控制培養條件，達到優質高產的目的，就需要對培養液中的污染情況、菌絲活力、菌絲體含量、菌絲球數量、PH值、總糖及還原糖、氨基酸、溶氧系數等的變化進行檢測。現將有關的檢測方法介紹如下。
（一） 感官檢查。可采用“看、旋、嗅”的步驟進行檢查。
看：將樣品靜置桌上觀察。一看菌液顏色和透明度，正常發酵醪液（培養液）一般呈白色或淡黃色，清澈透明，菌絲顏色因菌種的不同或菌種見光程度而異，老化后顏色變深；染雜菌的醪液則混濁不透明。醪液變混，有兩種可能性，一是細菌污染應予以淘汰；二是由于菌絲生長粘稠過大所致。若難以判斷，可進行鏡檢。二看菌絲形態和大小，正常的菌絲大小一致，呈球狀、片狀、絮狀，菌絲粗壯，線條分明；而染雜菌后，菌絲纖細，輪廓不清。三看上清液與沉淀的比例，菌絲體占比例越大越好，較好的液體菌種，在瓶中所占比例可達80%左右。四看pH值指標是否變色，在培養液中加入甲基紅或復合指標劑，經3～5天顏色改變，說明培養液pH值到達5.0左右，為發酵點；如果在24小時內即變色，說明因雜菌快速生長而使培養液酸度劇變。五看有無酵母線，如果在培養液與空氣交界處的瓶壁上有灰色條狀附著物，說明為酵母菌污染所致，此稱為酵母線。
旋：手提樣品瓶輕輕旋轉一下，觀其菌絲體的特點。醪液的粘稠度高，說明菌種性能好；稀薄者表明菌球少，不宜使用。菌絲的懸浮力好，放置5分鐘不沉淀，表明菌種生長力強；反之，如果菌絲極易沉淀，說明菌絲已老化或死亡。再次觀其菌絲狀態，大小不一，毛刺明顯，表明是供氧不足；如果菌球縮小且光滑，或菌絲纖細并有自溶現象，說明污染了雜菌。
嗅：菌種培養前期，因菌液中含有大量單、多糖類營養物質，因而糖香味很濃，隨著營養的被利用，菌液的糖香味越來越淡，取而代之的是或有或無的菌絲特有的芳香氣味。而染菌的培養液則散發出酸、甜、霉臭、酒精等各種異味。
除以上幾點直觀檢測外，還可用試管斜面培養基進行檢查，有很好的實用性。檢驗方法： 虎奶菇液體菌種檢驗可分二次進行，第一次在培養24h—36h時取樣，第二次在第培養36h—48h時取樣。無菌條件下接入試管培養基中，塞上棉塞， 放入培養室或恒溫培養箱內進行培養，溫度為26℃—30℃ ，培養的24h—36h之間進行觀察。如菌球萌發變潔白，接種面無紅、黃、綠、黑色雜菌，證明液體菌種生長正常，液體菌種生長成熟，后即可使用接種；否則，菌球萌發不潔白，接種面出現紅、黃、綠、黑色雜菌菌落，說明液體菌種已污染雜菌。 |
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